Acido vanillilmindalico (definizione nelle urine secondo VV Menshikov e TD Bolshakova)

Acido vanilliamelico

Acido vanillilmindalico (definizione nelle urine secondo VV Menshikov e TD Bolshakova). I prodotti finali del metabolismo dell'adrenalina e della norepinefrina, di cui circa il 40% nelle urine è acido vanilendmandelico, il prodotto dell'ossimetilazione e della deaminazione ossidativa di queste catecolamine, sono escreti 50 volte di più con le urine rispetto alle catecolamine libere.

Reagenti: 1. 3 n. HCl e 1N HCl. HCl.
2. Etile acetato.
3. Soluzione di NaCl saturo.
4. Etanolo assoluto.
5. Tampone acetato pH 6 (5 ml di acido acetico glaciale a 1 L di acqua).
6. Paranitroanilina diazotata:
a) 0,5 g di nitroanilina, 10 ml di HCl concentrato, 490 ml di acqua vengono sciolti riscaldando. Conservare in frigorifero;
b) soluzione allo 0,2% di NaNO 2 . Conservare in frigorifero;
c) soluzione al 10% di K 2 CO 3 .

Prima dell'uso a freddo, preparare la miscela: 1 volume a + 1 volume b, dopo 4-5 minuti 2 volumi c.

La miscela è adatta per diversi minuti.
7. Soluzione di metanolo alcalino, 2 parti di metanolo + 1 parte di soluzione al 2% di Na 2 CO 3 ; versato prima dell'uso al dosaggio di 4 ml per campione.
8. Lo standard dell'acido vanillare-alchelico; una soluzione acquosa basica con una concentrazione di 100 μg per ml.

Per tracciare la curva, a 0,01; 0,02; 0,03 e 0,04 ml di questa soluzione, corrispondenti a 1, 2, 3, 4 μg dello standard, nonché 1, 2, 3, 4 μg di campioni di urina dallo stadio di elettroforesi.

La determinazione è fatta dalla quantità giornaliera di urina.

Per lo studio, 1 ml viene portato in una provetta o cono con un tappo di terra. 1 N. soluzione di HCl, il pH del campione è regolato a 1; 1 ml di soluzione di NaCl satura viene aggiunto per rimuovere le impurità.

L'acido vanilliamandelico viene estratto con due parti da 4 mL di etilacetato, agitate per 1 minuto ciascuna e regolate per 20 minuti. Lo strato di acetato di etile viene versato in un altro cono e quindi essiccato a secco in una corrente d'aria leggera in un bagno d'acqua a 40-50 °. Il residuo secco viene sciolto in 0,2 ml di etanolo assoluto (due porzioni da 0,1 ml, lavando le pareti del cono) e trasferito con una micropipetta su un nastro da carta cromatografica largo 4 cm, lungo 43 cm in una sezione larga 1 cm a 13,5-14 , 5 cm dall'estremità catodica del nastro.

Il nastro viene pre-bagnato con una soluzione tampone e stirato in un apparecchio per elettroforesi. L'elettroforesi viene effettuata in camere di produzione nazionale in tampone acetato; intensità attuale. 1 milliampere per nastro con una tensione di 380-420 V per 18 ore. Dopo 18 ore, i nastri vengono fissati in un forno di essiccazione a 80 ° per 30 minuti, spruzzati con una paranitroanilina tinta-diazotata appena preparata. Quindi asciugato all'aria per 1-2 ore. L'acido vaniglia-mandelico si manifesta sotto forma di una striscia viola 12-14 cm dal luogo di applicazione all'anodo. Questa striscia viene tagliata, posta in una provetta chimica ed eluita per un'ora (durante questo periodo è necessario scuotere vigorosamente i campioni 2-3 volte) in 4 ml di alcali di metanolo.

Quindi la spettrofotometria dell'eluato dell'acido VanAylmandelico viola è fatta a 520 mmK o fotoelettrocolorimetria alla FEC con un filtro verde. In entrambi i casi, prendere le cuvette con uno spessore dello strato di 1 cm. Come controllo, utilizzare un eluato da un pezzo spruzzato di una striscia larga 1 cm senza frazioni di urina.

I valori di controllo vengono sottratti dall'esperimento, la quantità di microgrammi dell'acido vanillare-mandelico in 1 ml di urina viene determinata dalla curva di calibrazione e il risultato viene moltiplicato per la diuresi. Il contenuto di acido al giorno o, che è più conveniente per le singole porzioni di urina, in microgrammi per 1 mg di creatinina, per i quali la creatinina nelle urine è determinata dal metodo di Jaffe.

Questo metodo apre l'88,1% dello standard aggiunto ai campioni di urina; la differenza media tra i campioni paralleli è ± 3,79%.

Valori normali dell'acido vanillilmandelico: 0,7-3,8 mg / giorno. o 0,6-3,0 microgrammi / mg di creatinina.