elettroforesi

elettroforesi

L'elettroforesi è il processo di movimento diretto di particelle disperse in un liquido in un campo elettrico costante. Le particelle della stessa sostanza portano le cariche dello stesso segno. In un campo elettrico, le particelle caricate positivamente si spostano sull'elettrodo negativo - il catodo, particelle caricate negativamente sull'elettrodo positivo - l'anodo. Il movimento delle particelle verso il catodo è talvolta chiamato cataforesi, all'anodo - anaforesi. La velocità di movimento dipende dalla massa delle particelle e dalla loro carica nelle condizioni date, grazie alla quale l'elettroforesi rende possibile separare le miscele di sostanze nelle loro componenti costitutive.

schema di elettroforesi
Fig. 1. Schema di elettroforesi libera (frontale). La posizione dei confini della sezione: a - per sperimentare; b - dopo l'esperienza. 1 - elettrodi; 2 - solvente ; 3 - soluzione proteica.

Esistono i seguenti tipi di elettroforesi. 1. Elettroforesi libera (frontale). In questo caso, l'elettroforesi viene eseguita in dispositivi, una parte essenziale del quale è il tubo a forma di U (Fig. 1). Il fondo del tubo viene riempito con l'oggetto di prova, ad esempio una soluzione proteica, su cui è stratificato il solvente. Gli elettrodi collegati a una sorgente DC sono immersi nel solvente. In questo caso, le particelle di proteine ​​caricate elettricamente si spostano su uno degli elettrodi, a seguito del quale l'interfaccia tra la soluzione e il solvente sale in un ginocchio (limite ascendente) e nell'altro scende (limite discendente). Dispositivi per elettroforesi libera, dotati di un dispositivo per la registrazione automatica del movimento di ciascun componente nell'oggetto in studio, sono utilizzati nell'analisi dei sistemi dispersi, nella separazione dei singoli componenti da essi e negli studi clinici sul siero del sangue.

2. Elettroforesi su portatori (elettroforesi di zona). Carta, gel di amido, agar, poliuretano, ecc. Sono usati come trasportatori: nei laboratori clinici l'elettroforesi su carta è stata particolarmente utilizzata per lo studio del siero del sangue: su una striscia di carta speciale, imbevuta di una soluzione tampone appropriata (vedi), metti una goccia di siero. Le estremità delle strisce sono immerse in tazze riempite con questa soluzione tampone e dotate di elettrodi. Quando si passa una corrente continua, le singole proteine ​​del siero si muovono lungo una striscia a velocità diverse, e talvolta in direzioni diverse. Dopo un certo tempo, il passaggio di corrente viene interrotto, la striscia di carta viene essiccata e trattata con un reagente per proteine. Allo stesso tempo su elettroforegramma di carta ha rivelato macchie macchiate. Per il numero di punti, viene valutata la quantità di frazioni proteiche e dall'intensità delle macchie coloranti - il contenuto quantitativo di ciascuna frazione proteica nel siero in esame.

Recentemente, l'elettroforesi in strati sottili di gel depositati su lastre di vetro (elettroforesi su disco) e collocati in tubi di vetro è stata ampiamente utilizzata nella ricerca e nella diagnostica clinica.

Studi elettroforetici . Nella pratica clinica, l'elettroforesi zonale viene utilizzata per studiare la composizione proteica dei fluidi corporei. L'elettroforesi su carta viene spesso utilizzata come la tecnica più semplice per l'esecuzione. L'elettroforesi su gel di agar e amido viene utilizzata nella pratica medica principalmente nella ricerca scientifica.

Usando l'elettroforesi su carta, frazioni di proteine, lipoproteine, glucoproteine, così come le frazioni proteiche di urina, succo gastrico, essudati, ecc., Sono separate nel sangue. 2 (α 2 ) -, beta (β) - e gamma (γ) -globuline. Normalmente, il loro rapporto è più o meno costante. In alcune malattie, questi rapporti cambiano, il che può avere valore diagnostico e prognostico. Ad esempio, nei processi infiammatori acuti, il contenuto di α 2 -globuline nel sangue aumenta; nel periodo di sviluppo di immunità, il contenuto di γ-globulins aumenta; nelle lesioni epatiche, nel contenuto di albumina, ecc., in alcune malattie (ad esempio il mieloma), nel plasma sanguigno compaiono proteine ​​patologiche (paraproteine) che possono essere rilevate usando metodi di elettroforesi, che ha un grande valore diagnostico.

L'elettroforesi è il fenomeno del movimento direzionale di particelle ultramicroscopiche e microscopiche sotto l'influenza di una differenza di potenziale applicata esternamente osservata in sospensioni, emulsioni, soluzioni colloidali, soluzioni di composti molecolari alti (per esempio, proteine ​​dell'acido nucleico, polisaccaridi, ecc.).

L'elettroforesi è spiegata dalla presenza di particelle microscopiche e ultramicroscopiche di cariche elettriche, che sorgono come risultato dell'adsorbimento selettivo da parte di particelle di ioni dal mezzo di dispersione circostante o come risultato della dissociazione di gruppi ionogeni che costituiscono la superficie delle particelle. Il segno della carica elettrica di una particella dipende sia dalla natura delle particelle stesse sia dalla composizione del mezzo di dispersione. Particelle della stessa sostanza possono essere caricate sia positivamente che negativamente quando si modifica la composizione del mezzo di dispersione. Ad esempio, le macromolecole proteiche in soluzioni il cui pH è inferiore al punto isoelettrico di questa proteina (vedi Ampholytes) sono positivamente caricate e si muovono in un campo elettrico al polo negativo - catodo, e in soluzioni il cui pH è maggiore del punto isoelettrico della proteina, le sue macromolecole sono caricate negativamente e passare al polo positivo - l'anodo. Il movimento delle particelle verso il catodo è talvolta chiamato cataforesi, all'anodo - anaforesi.

Diversi metodi sono utilizzati per studiare l'elettroforesi.

L'elettroforesi frontale più accurata o il metodo del limite mobile. I dispositivi utilizzati per l'elettroforesi frontale sono variati nel design, ma ognuno di essi include una cuvetta elettroforetica, solitamente un tubo a forma di U (Fig. 1). La parte inferiore del tubo viene riempita con il liquido di prova, ad esempio una soluzione colloidale, sulla quale viene stratificata una soluzione elettrolitica diluita con una conduttività elettrica uguale a quella della soluzione colloidale. Gli elettrodi non polarizzabili collegati a una fonte di corrente costante sono posti in curve a tubo aperto. Quando la corrente è attivata, le particelle colloidali con un singolo fronte (come le particelle in questa soluzione colloidale hanno la stessa carica elettrica) si spostano su uno degli elettrodi, risultando in un'interfaccia tra la soluzione colloidale e la soluzione elettrolitica in una curva del tubo (il confine ascendente), e nell'altro ginocchio cadono rispettivamente (bordo discendente). Spostare l'interfaccia è facile da osservare se la soluzione colloidale è colorata. Se la soluzione colloidale è incolore, l'interfaccia tra esso e la soluzione elettrolitica può essere resa visibile illuminando il dispositivo da un lato; tuttavia, la soluzione colloidale sarà opalescente. A volte con questo scopo usano la capacità di soluzioni colloidali o soluzioni di composti molecolari ad alta fluoresce sotto l'azione dei raggi ultravioletti.


Fig. 1. cuvetta elettroforetica (schema): 1 - il liquido di prova; 2 - soluzione elettrolitica diluita; 3 - elettrodi.

La velocità U del movimento elettroforetico è correlata al potenziale elettrocinetico delle particelle (la differenza di potenziale tra il limite di scorrimento della particella e il mezzo di dispersione) dalla relazione:

dove D è la costante dielettrica del mezzo di dispersione, H è la caduta potenziale del campo elettrico per unità di lunghezza, n è 3.14, η è la viscosità del mezzo di dispersione e k è una costante a seconda della forma delle particelle (per piccole particelle sferiche, k-C, per particelle cilindriche k - 4). Il valore di U / H, cioè la velocità del movimento elettroforetico delle particelle, calcolata per una potenziale caduta di 1 V / cm, è chiamata mobilità elettroforetica. Questo valore, che ha una dimensione di cm 2 in -1 sec -1, per le proteine ​​(vicino al punto isoelettrico) è 0.4-0.8 · 10 -4 , per gli eritrociti di vari animali - 1.0-1.7 · 10 -4 e così via

Una tecnica di elettroforesi frontale perfetta per complesse miscele di proteine ​​e altri biopolimeri fu sviluppata nel 1937 da A. Tiselius. Il dispositivo Tizelpus e le sue varie modifiche, che consentono di registrare automaticamente il movimento dell'interfaccia di ciascun componente nella miscela utilizzando speciali dispositivi ottici e diagrammi speciali - elettroforegrammi (Fig. 2), sono ampiamente utilizzati per studiare sieri normali e patologici, determinare la composizione di miscele proteiche, determinare purezza delle proteine.


Fig. 2. Elettroforegrammi su Tizelius: 1 - siero umano normale; 2 - plasma sanguigno in mieloma multiplo; 3 - siero con nefrosi.

L' elettroforesi di zona viene effettuata nel mezzo di alcuni portatori indifferenti, ad esempio in agar, gel di amido, gelatine, nonché su tipi speciali di carta da filtro. L'elettroforesi su carta (elettroforesi su carta) è particolarmente diffusa nello studio e nella separazione di proteine, acidi nucleici, steroli, amminoacidi, acidi grassi e altre sostanze biologicamente attive. L'elettroforesi su carta viene effettuata con una potenziale caduta di circa 15-20 V / cm e una corrente di 3-5 mA. La miscela di prova (solitamente 0,01-0,04 ml di soluzione in tampone) viene applicata sotto forma di una linea nel mezzo di una striscia di carta, le cui estremità sono immerse in soluzioni di elettrodi dotate di elettrodi non polarizzabili. Al termine dell'elettroforesi, la carta viene asciugata, se necessario, trattata con uno speciale reagente che colora i singoli componenti della miscela, che formano più bande in base al numero di componenti. L'intensità del colore delle bande dell'elettroforegramma può essere giudicata sulla quantità relativa di ciascun componente nella miscela.

Il metodo microscopico di elettroforesi consiste nel determinare la velocità di movimento delle particelle visibili in un microscopio in un campo elettrico: cellule batteriche, eritrociti, particelle di sospensioni ed emulsioni, ecc. Per la microelettroforesi vengono utilizzate micro cuvette speciali dotate di elettrodi.

Vedi anche Immunoelettroforesi.