Microscopia elettronica

Microscopia elettronica

La microscopia elettronica è un metodo per studiare strutture che sono al di fuori dell'ambito di un microscopio ottico e hanno dimensioni inferiori a un micron (da 1 micron a 1-5 Å).

L'azione del microscopio elettronico (Fig.) Si basa sull'uso di un flusso di elettroni direzionale, che svolge il ruolo di un raggio di luce in un microscopio ottico, e i magneti (lenti magnetiche) svolgono il ruolo di lenti.

A causa del fatto che diverse parti dell'oggetto in studio trattengono gli elettroni in modi diversi, un'immagine in bianco e nero dell'oggetto in studio viene ottenuta sullo schermo del microscopio elettronico, ingrandito di decine e centinaia di migliaia di volte. In biologia e medicina, i microscopi elettronici a trasmissione sono principalmente utilizzati.

La microscopia elettronica ebbe origine negli anni '30, quando furono ottenute le prime immagini di alcuni virus (virus del mosaico del tabacco e batteriofagi). Attualmente, la microscopia elettronica ha trovato la più ampia applicazione in citologia , microbiologia e virologia, portando alla creazione di nuove branche della scienza. La microscopia elettronica degli oggetti biologici utilizza metodi speciali per la preparazione dei farmaci. Ciò è necessario per identificare i singoli componenti degli oggetti studiati (cellule, batteri, virus, ecc.), Nonché per preservare la loro struttura in condizioni di alto vuoto sotto il fascio di elettroni. Con l'aiuto della microscopia elettronica, si studia la forma esterna dell'oggetto, si organizza l'organizzazione molecolare della sua superficie e si studia la struttura interna dell'oggetto usando il metodo delle sezioni ultrasottili.

La microscopia elettronica in combinazione con metodi di ricerca biochimica, citochimica, immunofluorescenza e analisi strutturale a raggi X consente di giudicare la composizione e la funzione degli elementi strutturali di cellule e virus.
microscopio elettronico
Microscopio elettronico degli anni '70 del secolo scorso

Microscopia elettronica: lo studio di oggetti microscopici utilizzando un microscopio elettronico.

Un microscopio elettronico è uno strumento elettronico-ottico che ha una risoluzione di diversi angstrom e consente di esaminare visivamente la struttura fine delle strutture microscopiche e persino alcune molecole.

Una pistola a tre elettrodi composta da un catodo, un elettrodo di controllo e un anodo funge da sorgente di elettroni per creare un fascio di elettroni che sostituisce un raggio di luce (figura 1).


Fig. 1. Pistola a tre elettrodi: 1 - catodo; 2 - elettrodo di controllo; 3 - fascio di elettroni; 4 - l'anodo.

Le lenti elettromagnetiche utilizzate in un microscopio elettronico invece di quelle ottiche sono solenoidi multistrato racchiusi in gusci fatti di materiale magneticamente morbido, con una fessura non magnetica all'interno (figura 2).


Fig. 2. Lente elettromagnetica: punta a 1 polo; 2 - anello in ottone; 3 - avvolgimento; 4 - shell.

I campi elettrici e magnetici generati nel microscopio elettronico sono assialmente simmetrici. A causa dell'azione di questi campi, le particelle cariche (elettroni) che emergono da un singolo punto di un oggetto all'interno di un piccolo angolo vengono nuovamente raccolte nel piano dell'immagine. L'intero sistema ottico-elettronico è racchiuso in una colonna di microscopi elettronici (figura 3).


Fig. 3. Sistema ottico-elettronico: 1 - elettrodo di controllo; 2 - il diaframma del primo condensatore; 3 - il diaframma del secondo condensatore; 4 - stigmatore del secondo condensatore; 5 - oggetto; 6 - obiettivo; 7 - stigmator dell'obiettivo; 8 - stigmatore con lente intermedia; 9 - apertura dell'obiettivo di proiezione; 10 - catodo; 11 - l'anodo; 12 - il primo condensatore; 13 - il secondo condensatore; 14 - correttore di messa a fuoco; 15 - tabella porta oggetti; 16 - diaframma; 17 - diaframma selettore; 18 - lente intermedia; 19 - obiettivo di proiezione; 20 - schermo.

Il fascio di elettroni creato dal cannone elettronico viene guidato nel campo di azione delle lenti del condensatore, che consentono di variare ampiamente la densità, il diametro e l'apertura del fascio incidente sull'oggetto in esame. Nella camera degli oggetti c'è un tavolo, il cui design fornisce il movimento dell'oggetto in direzioni reciprocamente perpendicolari. In questo caso, è possibile ispezionare in modo coerente un'area di 4 mm 2 e selezionare le aree più interessanti.

Dietro la telecamera di un oggetto c'è una lente obiettiva, che consente di ottenere un'immagine nitida di un oggetto. Fornisce anche la prima immagine ingrandita dell'oggetto e, con l'aiuto di obiettivi successivi, intermedi e di proiezione, l'ingrandimento totale può essere portato al massimo. L'immagine dell'oggetto appare sullo schermo, luminescente sotto l'azione degli elettroni. Dietro lo schermo ci sono lastre fotografiche. La stabilità del cannone elettronico, così come la chiarezza dell'immagine insieme ad altri fattori (alta tensione costante, ecc.) Dipendono in gran parte dalla profondità della rarefazione nella colonna del microscopio elettronico, quindi la qualità dello strumento è determinata in gran parte dal sistema del vuoto (pompe, canali di pompaggio, rubinetti, valvole, guarnizioni) (Fig. 4). Il vuoto necessario all'interno della colonna è ottenuto grazie all'elevata efficienza delle pompe per vuoto.

Un vuoto preliminare nell'intero sistema del vuoto crea una pompa meccanica a vuoto, quindi entra in gioco una pompa di diffusione dell'olio; Entrambe le pompe sono collegate in serie e forniscono un alto vuoto nella colonna del microscopio. L'introduzione di una pompa booster dell'olio nel sistema di microscopia elettronica ha permesso di scollegare la pompa principale per un lungo periodo.


Fig. 4. Schema di vuoto del microscopio elettronico: 1 - una trappola raffreddata dall'azoto liquido (refrigerante); 2 - valvola per alto vuoto; 3 - pompa di diffusione; 4 - valvola di bypass; 5 - piccolo cilindro tampone; 6 - pompa di innesco; 7 - pompa per vuoto meccanica di linea; 8 - valvola della valvola a quattro vie; 9 - grande serbatoio tampone; 10 - colonna del microscopio elettronico; 11 - ingresso dell'aria della valvola nella colonna del microscopio.

Il circuito elettrico del microscopio consiste di sorgenti ad alta tensione, filamento di catodo, alimentazione di lenti elettromagnetiche, nonché un sistema che fornisce una tensione di rete alternata al motore della pompa di prevuoto, al forno della pompa di diffusione e all'illuminazione del pannello di controllo. Richieste molto elevate sul dispositivo di alimentazione: ad esempio, per un microscopio elettronico ad alta risoluzione, il grado di instabilità dell'alta tensione non deve superare 5 · 10 -6 in 30 secondi.

Un fascio di elettroni intensi si forma come risultato dell'emissione termica. La sorgente del filamento del catodo, che è un filamento di tungsteno a forma di V, è un generatore ad alta frequenza. La tensione generata con una frequenza di oscillazione di 100-200 kHz fornisce un fascio di elettroni monocromatico. La potenza della lente del microscopio elettronico è fornita da una corrente costante altamente stabilizzata.


Fig. 5. Microscopio elettronico UEMV-100B per lo studio di microrganismi viventi.

Gli strumenti sono prodotti (figura 5) con una risoluzione garantita di 4,5 Å; In alcune immagini uniche, è stata ottenuta una risoluzione di 1,27 Å, che si avvicina alle dimensioni di un atomo. Un aumento utile è 200.000.

Il microscopio elettronico è uno strumento di precisione che richiede metodi speciali di preparazione dei farmaci. Oggetti biologici a basso contrasto, quindi devi aumentare artificialmente il contrasto del farmaco. Esistono diversi modi per aumentare il contrasto dei farmaci. Quando il farmaco è ombreggiato con un platino, tungsteno, carbonio, ecc., È possibile determinare le dimensioni lungo tutti e tre gli assi del sistema di coordinate spaziali sulle immagini del microscopio elettronico. Con contrasto positivo, il farmaco si combina con sali di metalli pesanti idrosolubili (acetato di uranile, monossido di piombo, permanganato di potassio, ecc.). In caso di contrasto negativo, la preparazione è circondata da un sottile strato di sostanza amorfa ad alta densità impenetrabile per elettroni (molibdato di ammonio, acetato di uranile, acido tungstico fosforico, ecc.).

La microscopia elettronica dei virus (scansione dei virus) ha portato a progressi significativi nello studio della struttura submolecolare dei virus ultra-sottile (vedi). Insieme ai metodi di ricerca fisici, biochimici e genetici, l'uso della microscopia elettronica ha contribuito all'emergenza e allo sviluppo della biologia molecolare. L'argomento di studio di questa nuova sezione della biologia è l'organizzazione submicroscopica e il funzionamento di cellule umane, animali, piante, batteri e micoplasmi, nonché l'organizzazione della rickettsia e dei virus (Figura 6). Virus, grandi proteine ​​e molecole di acido nucleico (RNA, DNA), singoli frammenti di cellule (ad esempio la struttura molecolare della membrana cellulare batterica) possono essere esaminati con un microscopio elettronico dopo un trattamento speciale: ombreggiatura metallica, contrasto positivo o negativo con uranilacetato o fosforo acido tungstico, così come altri composti (Figura 7).

Fig. 6. Coltura cellulare del cynomolgus del tessuto cardiaco della scimmia infettata dal virus variola (X 12 000): 1 - nucleo; 2 - mitocondri; 3 - citoplasma; 4 - il virus.
Fig. 7. Virus dell'influenza (contrasto negativo (X450 000): 1 - guaina; 2 - ribonucleoproteina.

Con il metodo del contrasto negativo sulla superficie di molti virus, sono stati rilevati gruppi localizzati di molecole proteiche, i capsomeri (Fig. 8).

Fig. 8. Frammento della superficie del capside del virus dell'herpes. Singoli capsomeri (X500 000) sono visibili: 1 - vista laterale; 2 - vista dall'alto.
Fig. 9. Sezione ultrasottile del batterio Salmonella typhimurium (X80 000): 1 - nucleo; 2 - shell; 3 - citoplasma.

La struttura interna di batteri e virus, così come altri più grandi oggetti biologici, può essere studiata solo dopo averli dissezionati con un ultratomo e rendendo le sezioni più sottili con uno spessore di 100-300 Å. (Fig. 9). Grazie a metodi migliorati di fissazione, versamento e polimerizzazione di oggetti biologici, l'uso di coltelli di diamante e vetro con ultratotizzazione, nonché l'uso di composti ad alto contrasto per colorare sezioni seriali, è stato possibile ottenere sezioni ultrasottili non solo di grandi dimensioni, ma anche dei più piccoli virus di esseri umani, animali, piante e batteri.