Studi citogenetici

Studi citogenetici

La ricerca citogenetica è un insieme di metodi di ricerca della relazione tra il fenomeno dell'eredità e la struttura delle cellule (in particolare le strutture del nucleo cellulare). Gli studi citogenetici svolgono un ruolo importante nel lavoro biomedico, in quanto vengono utilizzati per scoprire le caratteristiche genetiche, la variabilità (vedi), l'origine e l'evoluzione degli esseri viventi.

L'oggetto degli studi citogenetici sono principalmente i cromosomi (vedi) dell'uomo, degli animali e delle piante, aventi proprietà specifiche per ciascuna specie (numero, dimensioni, caratteristiche strutturali) e che formano la caratteristica cariotipica di un determinato organismo. Pertanto, i metodi di studi citogenetici sono usati nella costruzione di classificazioni naturali degli organismi viventi.

Negli studi citogenetici si presta particolare attenzione alla poliploidia - un fenomeno associato ad un aumento multiplo del numero di cromosomi, accompagnato dalla comparsa di una serie di nuove proprietà (aumento delle dimensioni complessive, gusto di frutta e verdura, vitalità delle piante, ecc.). Lo sviluppo del problema della poliploidia è di importanza pratica in agricoltura , nell'allevamento di piante e animali.

Usando studi citogenetici rivelano cambiamenti nei cromosomi che vengono trasmessi alla prole e in un certo modo influenzano le caratteristiche del corpo. Studiano i riarrangiamenti cromosomici dannosi, la perdita, la perdita o l'aggiunta di singoli cromosomi o sezioni di cromosomi. Essi rivelano il coinvolgimento del fattore ereditario nel verificarsi di un numero di malattie umane (vedi Malattie ereditarie), tra cui disturbi dello sviluppo, suscettibilità alle neoplasie maligne, ecc. Gli studi citogenetici hanno portato a una corretta comprensione della natura del disturbo da radiazioni .

Usando gli studi citogenetici, è stato trovato, ad esempio, che nei nuclei delle cellule di vari tessuti e organi, ma solo nelle femmine, ci sono formazioni intensamente colorate con coloranti speciali, i cosiddetti corpi di Barr o la cromatina sessuale (vedi). Si è scoperto che la cromatina sessuale si trova in molti animali e negli umani. La scoperta della cromatina sessuale ha permesso di determinare il sesso di una persona a livello cellulare (questo è di particolare importanza per la medicina legale), diagnosticare il sesso dell'embrione nelle prime fasi della gravidanza e risolvere una serie di altri problemi della pratica medica.

Vedi anche Genetica, Eredità.

Studi citogenetici - uno studio microscopico di specifiche strutture cellulari che determinano i processi di ereditarietà e sviluppo.

Gli studi citogenetici stanno diventando più ampiamente usati nella medicina clinica. Il metodo più semplice, veloce ed economico di analisi citogenetica è lo studio della cromatina sessuale.

La cromatina sessuale è un corpo della cromatina, che è assente nei maschi, e nelle femmine è adiacente all'involucro nucleare.

Quindi, questo piccolo corpo può servire come segno citologico del sesso, in connessione con il quale si chiama sesso cromatina.

La dimensione della cromatina sessuale di Taurus nell'uomo varia da 0,7 a 1,2 micron, la loro forma può variare (Fig. 1 - 3). Nelle donne, la cromatina sessuale è determinata in media nel 40% dei nuclei (Figura 4). È formato da uno dei cromosomi X del cariotipo femminile, che si trova in uno stato inattivo, a spirale. La cromatina sessuale può essere rilevata nelle cellule della mucosa della cavità orale, della vagina e dell'uretra, così come nelle cellule del sangue, nella pelle sottoposta a biopsia, nel tessuto adulto in coltura, nel tessuto embrionale e nelle cellule nervose.

Il metodo più semplice e conveniente per la determinazione della cromatina sessuale nelle cellule della mucosa orale è stato proposto da Tiri (N. Thiries) e migliorato da Sanderson (S. Sanderson). Per la ricerca prendere raschiature dalla membrana mucosa delle guance. Il materiale viene trasferito su un vetrino, asciugato all'aria e per 10 minuti. fissato in alcool metilico. La colorazione è fatta con una goccia di acetoorseina appena filtrata (1 g di orceina sintetica viene sciolta in 45 ml di acido acetico glaciale, riscaldata ad ebollizione e filtrata dopo raffreddamento, 55 ml di acqua distillata vengono aggiunti a 45 ml di soluzione filtrata) e la miscela viene nuovamente filtrata. Quando si esegue la microscopia con una lente a immersione, viene contato il numero di nuclei positivi alla cromatina per 100 cellule.

Lo studio della cromatina sessuale viene utilizzato per la determinazione del sesso citologico, diagnosi rapida e precoce di malattie associate a aberrazioni dei cromosomi sessuali (in particolare, Klinefelter, Shereshevsky - Sindromi di Turner, ecc.), Caratteristiche di un numero di processi fisiologici (in particolare, il ciclo mestruale), studi di generale e modelli locali di una serie di processi patologici e, soprattutto, neoplasie maligne, delucidazione dell'effetto di alcuni metodi e agenti terapeutici (antibiotici, corticosteroidi, droghe ittostatiche).

I metodi di analisi citogenetica includono anche lo studio del cariotipo (vedi).

È stato stabilito che il set cromosomico umano è costituito da 46 cromosomi (23 paia), due cromosomi sessuali (XX - in una donna, XY - in un uomo), 22 paia di autosomi (Figura 5) ed è caratterizzato da un'elevata costanza nelle cellule del corpo umano.

A seconda della lunghezza dei cromosomi e della posizione del loro centromero, l'intero set cromosomico è diviso in 7 gruppi: A, B, C, D, E, F, G.

Per studiare l'insieme cromosomico umano (cariotipo), vengono utilizzati i metodi di coltura dei leucociti del sangue periferico, i fibroblasti del tessuto embrionale, la coltura delle cellule della pelle e il metodo diretto per determinare il set cromosomico nelle cellule del midollo osseo.

Per la prima volta, il biologo sovietico G. K. Khrushchev (1935) riportò la riuscita coltivazione di leucociti non divisori. Nel 1958, P. Nowell propose di usare la fitoemagglutinina (PHA) per stimolare la divisione dei leucociti, una sostanza isolata dalle leguminose. La coltivazione dei leucociti effettuata con un metodo modificato e migliorato. 10 ml di sangue venoso prelevato sterile in una provetta con eparina (1 ml di eparina amplificata viene diluito 20 volte con soluzione di Hanks), posto per 30-40 minuti. nel frigo. Quindi 0,7 - 1 ml di soluzione di gelatina al 10% viene aggiunto sterilmente (nella scatola) al sangue per accelerare la sedimentazione degli eritrociti. Dopo aver sistemato il sangue, il plasma viene aspirato e posto in una beuta sterile. Il mezzo medio 199 o Eagle viene aggiunto al plasma alla velocità di 1,5 ml di terreno per 1 ml di plasma.

Per stimolare l'attività mitotica dei leucociti, alla miscela vengono aggiunti 0,2 ml di PHA. La sospensione cellulare risultante viene posta in un termostato a 37 ° per 72 ore. 2-3 ore prima della fissazione, ogni flacone (la sospensione di coltura viene versata in 1,5-2 ml in flaconi di tipo penicillina sterile) viene aggiunta con 0,5-0,75 μg di colchicina (soluzione di lavoro della colchicina: 10 μg per 1 ml acqua distillata) e continuare la coltivazione. Successivamente, le colture vengono centrifugate per 5 minuti. a 800 giri al minuto Il supernatante viene drenato, aggiungendo 3-5 ml di soluzione di citrato di sodio allo 0,95% riscaldata a 37 ° C, che fa gonfiare le cellule. Nella soluzione ipotonica, le cellule sono da 15 a 30 minuti, dopo di che il surnatante viene drenato, un fissativo viene aggiunto con cautela al sedimento (3 ore di alcool assoluto + 1 ora di acido acetico glaciale), posto in un frigorifero per 15 minuti, quindi ri-centrifugato e cambia la serratura. 1-2 gocce di sospensione cellulare vengono applicate ai vetrini di vetro sgrassato e asciugate sopra la fiamma o il fissatore viene acceso (preparazioni "bruciate"). Le preparazioni sono dipinte con blu policromo Unna, acetoorcein o Romanovsky. Il set cromosomico è studiato utilizzando la microscopia a immersione in 100 piastre metafase.

Per studiare i cromosomi, viene anche usato un metodo diretto per determinare l'insieme cromosomico nelle cellule del midollo osseo: 1 ml di punctato di midollo osseo appena aspirato viene posto in un matraccio con 30 ml di mezzo 199 e 3 ml di soluzione di colchicina (10 μg per 1 ml). Il contenuto del pallone viene delicatamente agitato per distribuire uniformemente le cellule e quindi centrifugato. Il surnatante viene drenato e 10 mi di soluzione di citrato di sodio allo 0,95%, riscaldata a t ° 37 °, viene aggiunta al precipitato. Le cellule vengono accuratamente risospese e poste in un termostato a 37 ° per 40-45 minuti. Successivamente viene eseguita nuovamente la centrifugazione, il surnatante viene drenato e al sedimento viene aggiunto un fissativo appena preparato costituito da 3 parti di alcol metilico e 1 parte di acido acetico concentrato. Dopo 10 minuti il pellet viene risospeso e lasciato nel fermo per altri 20 minuti. a temperatura ambiente, quindi centrifugato per 10 minuti, cambiare nuovamente il fissativo e preparare i preparati allo stesso modo di quando si fissa la coltura dei leucociti del sangue.

Lo studio del cariotipo può essere utilizzato con successo per la diagnosi delle malattie cromosomiche umane. Recentemente, è stato identificato un intero gruppo di malattie cromosomiche associate alla patologia di entrambi i cromosomi genitali e autosomici (vedere Malattie ereditarie). Oltre a modificare il numero di cromosomi, forse una violazione della loro morfologia. Pertanto, nella leucemia mieloide cronica, si osserva un cromosoma acrocentrico insolitamente piccolo della 21a coppia. La comparsa di aneuploidia (aumento o diminuzione del numero di cromosomi, numero aploide non multiplo di cromosomi) può servire come test prognostico per la leucemia allo stadio terminale.

Gli studi citogenetici si stanno avvicinando con quelli oncologici. È possibile che i cambiamenti nel set cromosomico durante i processi oncologici possano essere utilizzati per la loro diagnosi precoce. Per gli studi citogenetici vengono utilizzati metodi di colture tissutali a breve termine: il metodo del coagulo plasmatico, seguito dallo studio delle sottocolture e il metodo di colture di sospensione principalmente tripsinizzate. Preferire il primo metodo, poiché il secondo richiede una grande quantità di tessuto per ottenere una sospensione di cellule in grado di riprodursi.

Per creare le condizioni più favorevoli del metabolismo utilizzando il siero placentare umano, non tossico, estratto embrionale al 50% di feti umani abortiti, che viene preparato nel medium di Eagle. Per fissare i pezzi sul vetro e collegare un numero maggiore di cellule quando si usano colture in sospensione, utilizzare plasma umano secco di gruppo IV diluito prima dell'uso con il siero medio placentare di Eagle 1: 1; dopo l'introduzione dell'espianto aggiungere l'estratto embrionale. La coltivazione viene effettuata in fiale di Carrel (vedi Cultura dei tessuti).

Fig. 1. Cromatina sessuale sotto forma di un ovale (X1100).
Fig. 2. Cromatina sessuale a forma di triangolo (XI100).
Fig. 3. Cromatina sessuale sotto forma di ispessimento dell'involucro nucleare (X1100).
Fig. 4. Nucleo di cromatina negativa in una donna (X1100).
Fig. 5. Cariotipo femminile normale (x1100).