Metodo di carta per cromatografia su colonna

cromatografia

La cromatografia è un metodo per separare le miscele nelle loro sostanze costituenti, in base alle differenze nel grado di assorbimento delle singole sostanze durante il loro passaggio attraverso lo strato dell'assorbitore.

La cromatografia viene utilizzata per la determinazione qualitativa e quantitativa di sostanze in vari tipi di miscele per scopi diagnostici (ad esempio, cambiamenti nel contenuto di singoli amminoacidi nel plasma sanguigno, nei tessuti del fegato e in altri organi, che si verificano in numerose condizioni patologiche, ecc. Ecc.). p.), così come a fini preparativi per ottenere molti, comprese le sostanze biologicamente attive.

I seguenti tipi di cromatografia sono ampiamente utilizzati nei laboratori clinici, sanitari e farmaceutici.

cromatografia su colonna
Fig. 1 cromatografia su colonna: 1 - soluzione di prova; 2 - strato assorbente; 3 - zone formate da sostanze che fanno parte della miscela analizzata.
Fig. 2. Cromatografia su carta: 1 - striscia di carta; 2 - macchie colorate corrispondenti a diverse sostanze che facevano parte della soluzione analizzata; 3 - una goccia della soluzione analizzata; 4 - linea di partenza; 5 - solvente .

La cromatografia su colonna viene effettuata facendo passare la soluzione di test contenente diversi soluti attraverso un tubo di vetro (colonna - fig.1) riempito con un assorbitore in polvere (assorbente). A causa dell'assorbimento diseguale (assorbimento) di varie sostanze, vengono separati. Migliore è la sostanza assorbita, il ritardo è nelle parti più alte della colonna. La determinazione della natura di una sostanza viene effettuata sia con il suo caratteristico colore della sostanza, sia passando attraverso una colonna (dopo la separazione della miscela) una soluzione di un reagente dello sviluppatore, che forma composti specificamente colorati con le sostanze analizzate. Lo strato assorbente così ottenuto con zone di colore diverso è chiamato cromatogramma. Le sostanze sorbed sulla colonna possono essere successivamente forzate (lavate) e raccolte in frazioni. Questo processo è chiamato eluizione.

La cromatografia su carta viene eseguita su strisce di tipi speciali di carta. Una goccia della soluzione di prova viene applicata a una certa distanza dal bordo della striscia di carta (Fig. 2). Il bordo della striscia è posto nel solvente appropriato, che si muove attraverso i capillari della carta lungo la striscia. Quando ciò accade, la separazione delle sostanze: peggio viene assorbita la sostanza, più lontano sarà dalla linea di partenza. Al termine della separazione, la striscia viene essiccata e spruzzata con una soluzione di un reagente che forma composti colorati caratteristici con le sostanze da rilevare.

La cromatografia in un sottile strato di assorbente è simile alla cromatografia su carta. La differenza è che in questo caso un sottile strato di assorbente in polvere (ad esempio, allumina, gel di silice, caolino, resina a scambio ionico) viene applicato sulla lastra di vetro. La tecnica di separazione della miscela analizzata in singole sostanze e i metodi per la loro determinazione qualitativa sono sostanzialmente gli stessi della cromatografia su carta.

Negli ultimi anni, i cosiddetti analizzatori automatici sono diventati sempre più comuni nella pratica clinica e di laboratorio, dispositivi che consentono l'analisi cromatografica tramite dispositivi automatici e contemporaneamente registrano i risultati su un nastro speciale.

Cromatografia (dal greco Chroma, cromatos - colore, colore e grafo - annotare, letteralmente - color painting) - metodo dinamico di assorbimento per separare le miscele di sostanze. Proposto da M. S. Tsvetom nel 1903 per l'analisi dei pigmenti vegetali. Successivamente, divenne un metodo universale per separare miscele di sostanze colorate e incolori di qualsiasi natura per scopi analitici e preparativi.

Il metodo consiste nell'assorbire la miscela iniziale da una piccola porzione di uno strato di assorbente granulato posto in una colonna e successivamente espandere le zone dei componenti (eluizione) facendo passare un solvente o soluzione eluente che non contiene i componenti della miscela analizzata - attraverso uno strato di assorbente. Durante l'eluizione, i componenti della miscela si muovono attorno allo strato assorbente a velocità diverse e, come risultato, vengono separati sull'assorbente sotto forma di zone isolate, e con ulteriore eluizione del sorbente vengono successivamente trasferiti al filtrato (Fig. 1). La cromatografia consente di ottenere sostanze pure, tra cui biologicamente attive (morfina, antibiotici, vitamine, ormoni, enzimi, ecc.). Invece di colonne sorbenti, viene spesso usata una polvere sottile depositata su una lastra di vetro (gel di silice, argilla, Al 2 O 3 , MgO, ecc.): Cromatografia su strato sottile (TLC) o strisce di carta da filtro (cromatografia su carta). In questo caso, i componenti della miscela formano macchie isolate; il rapporto tra le velocità del loro movimento e la velocità di movimento del fronte del solvente (valore Rf) caratterizza la natura della sostanza, l'area - la sua quantità. Questi metodi consentono di separare e analizzare 10 -8 - 10 -6 g di una sostanza. Nell'aspetto analitico, la cromatografia identifica una sostanza basata sul confronto delle velocità del suo movimento e del "testimone" sullo strato assorbente e facilita l'analisi quantitativa di miscele di componenti simili.


Fig. 1. Le fasi successive del processo di separazione cromatografica di una miscela di sostanze (a, b, ced): I - il cromatogramma primario; II - III - fasi successive di eluizione; sotto, le curve di uscita delle sostanze (a, b, e c).

Distinguere l'adsorbimento cromatografico, lo scambio ionico, la distribuzione e la sedimentazione; Recentemente, il metodo di filtrazione su gel è riferito a metodi cromatografici.

Cromatografia ad adsorbimento (AH). La base di AH è il processo di adsorbimento (vedi) dei componenti della miscela da parte del sorbente. In AH vengono utilizzati assorbenti porosi con una superficie specifica elevata (100-1000 m 2 / g). AH è ampiamente utilizzato per ottenere farmaci, analisi di materiali biologici, ecc.

Cromatografia a scambio ionico (IOC). Basato sull'assorbimento di ioni da parte dell'adsorbente a seguito di una reazione chimica eterogenea dello scambio ionico tra il sorbente e la soluzione analizzata. Nel CIO vengono utilizzate sostanze scambiatrici di ioni naturali e sintetiche (vedi Ioniti), l'assorbimento di quale dei componenti della miscela aumenta con un aumento della carica del componente ionico, e per ioni di uguale ampiezza la carica - con un aumento del raggio di ioni. Il CIO è il metodo più avanzato per l'analisi qualitativa e quantitativa di amminoacidi e peptidi. L'uso di un analizzatore automatico basato sul metodo di frazionamento degli amminoacidi sugli scambiatori di cationi solfonici secondo Moore, Speckman, Stein consente di analizzare fino a 60 composti contenenti azoto (figura 2); Un'analisi completa, per la quale sono sufficienti 0,01-0,025 micromoli di ciascun amminoacido, viene effettuata in 3-5 ore.


Fig. 2. Cromatogramma di aminoacidi liberi del plasma sanguigno deproteinizzato di una persona sana (1,7 ml); dimensione della colonna 69x0,9 cm; separazione di amminoacidi neutri e acidi.

Per la separazione di miscele di composti altamente molecolari (proteine, acidi nucleici, polisaccaridi acidi, ecc.) Utilizzare il Sephadex a scambio ionico (SI) o le ioniti lineari non scottanti a base di cellulosa (CI). SI viene ottenuto introducendo residui di un acido o di una base nel copolimero finito; Sono stati ottenuti due scambiatori di cationi - carbossimetilico (KMC) e sulfoethylsefadex (SES) e scambiatore anionico - dietilamminoetil-setadex (DEAE-C). CI sono eteri di cellulosa con diversi gruppi ionici; gli scambiatori di cationi sono ampiamente usati - carbossimetilcellulosa, fosfato cellulosa, sulfoetilcellulosa; scambiatori di anioni - dietilamminoetilcellulosa (DEAE-C, scambiatore anionico quasi universale), trietilaminoetilcellulosa (TEAE-C), scambiatore anionico debolmente basico - EKTEola-cellulosa (EKTEola-C), ottenuto dalla reazione della cellulosa con epicloridrina e trietanolammina. La capacità di scambio di SI è maggiore di QI e è 3-4,5 mEq / g.

Con l'aiuto di QI o SI, è stato ottenuto un grande successo nel campo dell'isolamento e della purificazione delle proteine, inclusi enzimi, ormoni, tossine, acidi nucleici e grandi polisaccaridi batterici. DEAE-C o EKTEOL-C, applicati in strato sottile su piastre, sono i migliori assorbenti per il frazionamento rapido e molto fine di nucleotidi e acidi nucleici.

Cromatografia di distribuzione (PX). La separazione dei componenti delle miscele in questa cromatografia è dovuta a differenze nei loro coefficienti di distribuzione tra la fase stazionaria trattenuta dal sorbente inerte e la fase mobile, sia per mezzo di solvente o gas; in quest'ultimo caso, si fa riferimento alla cromatografia di distribuzione del gas (GRH). PX è il metodo analitico e preparativo più comune di frazionamento di sostanze di struttura simile. Come un veicolo inerte, si usano sostanze prevalentemente polari - cellulosa (sotto forma di fogli di carta da filtro), meno spesso - gel di silice. La tecnica della cromatografia su carta è molto semplice; A seconda della direzione di movimento del solvente, si distinguono i cromatogrammi unidimensionali, bidimensionali o circolari. Il movimento del solvente sulla carta può essere effettuato in modo ascendente, discendente o orizzontale. La miscela analizzata viene applicata alla carta sotto forma di una goccia con un volume di 1-5 μl contenente 10-8 -10 -6 g di ciascun analita. Il flusso ascendente o discendente di solvente sposta i componenti della miscela lungo la carta, formando una catena (cromatogramma monodimensionale) o un modello (cromatogramma bidimensionale) di macchie (Fig. 3). Il contenuto di ciascun componente isolato è determinato con metodi convenzionali dopo l'estrazione di una sostanza da uno "spot" o, meno comunemente, direttamente sulla carta, ma dall'area spot, stabilita in base al colore, alla radioattività o all'assorbimento dei raggi ultravioletti da parte della sostanza.


Fig. 3. Un cromatogramma bidimensionale di una miscela di aminoacidi essenziali che costituiscono proteine ​​e fluidi biologici. Il primo solvente: butanolo - acido acetico; secondo solvente: fenolo - NH 3 . 1 - acido cisteico; 2 - acido aspartico; acido in-glutammico; 4 - serina; 5 - taurina; in - glicina; 7 - glutammina; 8 - treonina; 9 - alanina; 10 è β-alanina; 11 - idrossiprolina; 12 - tirosina; 13 - istidina; 14 - lisina; 15 - arginina; 16 - metionina sulfossido; 17 - acido amino-amminobutirrico; 18 - acido β-aminoisobutirrico; 19 - valina; 20 - fenilalanina; 21 - isoleucina; 22 - leucina; 23 - prolina.

Il GRH rende possibile con estrema precisione l'analisi delle sostanze ultramikrokolichestva (10 -11 - 10 -9 g) che nelle condizioni dell'analisi possono essere convertite in uno stato di gas o di vapore. Viene utilizzato per studiare i processi di respirazione e composizione dei gas ematici, la determinazione degli ormoni sessuali, gli ormoni della corteccia surrenale, gli acidi biliari, le vitamine liposolubili, in particolare le vitamine del gruppo D (D2 - D3), i lipidi e alcuni componenti volatili dei tessuti - alcoli inferiori, tioli, chetoni. Nella biochimica della nutrizione, GRH viene utilizzato per identificare le sostanze che determinano gli odori dei prodotti alimentari, come caffè, formaggio, carne arrostita, ecc.

Cromatografia di sedimenti Questa cromatografia provoca la formazione di componenti di miscele precipitate insolubili come risultato della loro interazione chimica con il reagente che impregna il sorbente. Negli studi biochimici e clinici, la cromatografia dei sedimenti non è ancora stata utilizzata.

Gel filtrazione (GF). La separazione delle sostanze mediante filtrazione su gel si basa sul fenomeno meccanico della setacciatura molecolare; con HF, molecole con dimensioni inferiori al diametro dei pori di un "sorbente" gonfio poroso omogeneo sono distribuite uniformemente tra le soluzioni "esterne" e "interne"; le grandi molecole non penetrano nel grano del "sorbente" e, quindi, si muovono lungo la colonna alla velocità del flusso del solvente. Negli studi biochimici, i più comuni sono i copolimeri porosi di destrano polisaccaride batterico parzialmente depolimerizzato con varie quantità di ponti idrofobi formati da residui di glicerolo (sephadex) o poliacrilammide (biogel). Aumentando il contenuto dell '"agente di reticolazione" si riduce la dimensione dei pori del setaccio e la capacità di rigonfiamento del copolimero, riducendo il suo assorbimento di grandi molecole, di solito sostanze con una mole grande. di peso. L'uso di diversi marchi Sephadex consente di separare le sostanze con mol. da 200 a 200.000 e bio-gel da 200 a 300.000. I gel "debolmente reticolati" sono utilizzati per l'analisi, l'isolamento e la purificazione di proteine, polisaccaridi, acidi nucleici. I gel "strettamente cuciti" consentono il frazionamento di amminoacidi, peptidi, zuccheri, nucleotidi. Piccoli gel vengono usati per separare il basso peso molecolare da sostanze ad alto peso molecolare e sostituire la dialisi.

I tipi di cromatografia considerati sono ampiamente implementati sotto forma di cromatografia su strato sottile (TLC), in cui il sorbente o trasportatore finemente macinato viene applicato con uno strato (0,1 - 0,3 mm) su una lastra di vetro. La tecnica per produrre cromatogrammi su strato sottile è simile alla cromatografia su carta; il vantaggio è la velocità di separazione e alta sensibilità. TLC su gel di silice, Al 2 O 3 , farina fossile, cellulosa a scambio ionico e convenzionale o Sephadex è il metodo più avanzato di microanalisi. Il TLC è utilizzato in studi biochimici e clinici per la separazione, identificazione e determinazione quantitativa di amminoacidi, peptidi, carboidrati, nucleotidi, ormoni, acidi grassi, proteine, ecc .; per esempio, una miscela di ATP e ADP nella quantità di 5 × 10-4 μmoli ciascuno può essere separata in uno strato sottile di cellulosa ECTEA in 4-5 minuti; una miscela di quattro nucleotidi viene separata in queste condizioni in 15 minuti. Nella chimica analitica utilizzata TLC, in cui i sorbenti più comuni sono l'allumina e il gel di silice.